CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。

科学家构造突变型的Cas9蛋白（称为Cas9n），使它的其中一个核酸酶活性结构域被失活，故Cas9n只能切割单链。 这样一来，就要设置两个朝向相反的Cas9n来产生双链断裂，并且这样断开DNA后产生的是黏性末端。

2023年1月16日 · Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) gene-editing technology is the ideal tool of the future for treating diseases by permanently...

和普通Cas9不同的是，Cas9n (Cas9 Nickase)上有一个D10A的氨基酸突变，这个突变使得Cas9不再导致DNA双链断裂和NHEJ修复（一种会引来突变的修复），而是会引起单链断裂和BER修复（一种不会引起突变的修复），如下图。

2024年4月17日 · Cas9（CRISPR-associated protein 9）是一种核酸酶，能够在特定的DNA序列上切割双链DNA。 在基因编辑中，研究人员设计了一个与目标DNA序列互补的单链RNA引导分子（sgRNA），将其与Cas9蛋白复合体一起导入目标细胞。

Cas9 (CRISPR associated protein 9, formerly called Cas5, Csn1, or Csx12) is a 160 kilodalton protein which plays a vital role in the immunological defense of certain bacteria against DNA viruses and plasmids, and is heavily utilized in genetic engineering applications. Its main function is to cut DNA and thereby alter a cell's genome.

Since nicks are generally repaired with high fidelity in eukaryotic cells, Cas9n can be leveraged to mediate highly specific genome editing, either via nonhomologous end-joining or homology-directed repair. Here we describe the preparation, testing, and application of Cas9n reagents for precision mammalian genome engineering.

例如，Cas9-nickase （Cas9n） 利用了 Cas9 通过两个核糖域（RuvC 和 HNH）的组合活动进行双链断裂 （DSB） 这一事实。将两个关键酶残留物之一转换为丙氨酸（D10A 或 H840A）会生成一个"刻痕"Cas9，无法生成双链断裂。

使用的RNA称为pegRNA，包含①和目标序列互补配对的序列②和目标序列大致相同但存在一些突变的序列。 将Cas9n与一个逆转录酶融合，Cas9n只能将DNA进行单链断裂，产生一个切口，融合的RT则 有可能 以pegRNA上②序列为模板，以切开的末端为引物，进行逆转录。 （也可能直接就解离了，不进行逆转录） 此时目标序列对面就有了两条互补序列，一条是原本的互补序列，一条是以②序列为模板合成的、与原本互补序列相比存在突变的一条互补序列，二者以翼式存在。 …

2019年9月27日 · Results: Here, we developed a CRISPR/Cas9n-based multiplex genome editing system for iterative genome editing in B. subtilis. This system enabled us to introduce various types of genomic modifications with more satisfying efficiency than using CRISPR/Cas9, especially in multiplex gene editing.