近期关于 CRISPR/Cas9 系统做编码基因的KO（敲除）的验证方法问题，收到很多咨询。 大体分成两个，分别是： 是否可以通过用 qPCR 检测目的基因的mRNA来验证是否有敲除效果？ 以及是否可以直接用 wb 验证目的蛋白的表达量来验证是否有敲除效果？ 因此决定写一篇文章对这两个问题作细致解答。 我们先看看CRISPR/Cas9介导编码基因KO的原理，在Cas9剪切DNA，导致双链断裂（DSB）后，细胞利用非同源末端连接（NHEJ）进行修复。 NHEJ修复会在DSB位点随 …

CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），Cas9的全称是CRISPR-associated protein 9，大家都简称为CRISPR/Cas9系统。 Jennifer Doudna 等人最初从原核生物中发现一种结构能够抵御外来遗传物质的入侵， 张峰 最先将这个系统应用于哺乳动物细胞的基因编辑，那么这个CRISPR/Cas9的结构是怎样的？ 又是如何起作用的？ 要如何使用它实现基因敲除？

2023年4月4日 · 图1. NMD途径导致的mRNA降解 图 2 PTC位置对于NMD效率的影响 图3. 193株KO敲除细胞系蛋白及mRNA表达情况

2021年10月23日 · 我们先看看CRISPR/Cas9介导编码基因KO的原理，在Cas9剪切DNA，导致双链断裂（DSB）后，细胞利用非同源末端连接（NHEJ）进行修复。 NHEJ修复会在DSB位点随机引入碱基的插入或者缺失（Indel）。 如果这些Indel不是3的倍数就会导致后续阅读框发生移码，这种移码往往会产生提前终止密码子（PTC），导致蛋白功能的丧失（提前翻译终止的多肽一般会被降解），从而达到KO效果。 因此，如果从这个角度来看的话，Cas9介导的KO影响的是蛋白 …

Yes, you can validate and quantify a CRISPR knockout cell line using quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). qPCR is a commonly used technique to assess changes in gene expression, and...

2024年12月15日 · qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR，qPCR)，即实时荧光定量PCR，是使用荧光探针（例如Taqman探针），在PCR过程中利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析。

2024年12月10日 · qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR，qPCR)，即实时荧光定量PCR，是使用荧光探针（例如Taqman探针），在PCR过程中利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析。

2024年9月12日 · 通过对KO细胞沉淀与WT细胞/对照细胞同时进行蛋白质组学前处理、数据采集和数据分析后，分析目标基因的多肽缺失情况以及相关蛋白的变化（火山图）可以分析：靶基因的敲除情况，以及由于靶基因的缺失而引起相关代谢通路的变化情况。

2021年10月26日 · 我们先看看CRISPR/Cas9介导编码基因KO的原理，在Cas9剪切DNA，导致双链断裂（DSB）后，细胞利用非同源末端连接（NHEJ）进行修复。 NHEJ修复会在DSB位点随机引入碱基的插入或者缺失（Indel）。 如果这些Indel不是3的倍数就会导致后续的阅读框发生移码， 这种移码往往会产生提前终止密码子（premature termination codon，PTC）,导致蛋白功能的丧失（提前翻译终止的多肽一般会被降解），从而达到KO效果。 因此，如果从这个角度来看的 …

通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等技术，可以检测mRNA的表达水平，从而判断基因敲除是否影响转录过程。 具体而言，利用特异性引物和荧光标记的探针，通过PCR扩增技术对mRNA进行定量分析。 如果基因敲除成功，则mRNA的表达量会明显降低。 四、表型分析. 表型分析是通过观察生物体的表型变化来间接鉴定基因敲除效果的方法。 例如，观察敲除基因后的生物体生长状况、生理指标等，可以间接反映基因敲除的效果。 如果基因敲除导致表型变化，则说明基因敲除成 …