2019年10月12日 · CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫，用于降解入侵的外源 DNA。 CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA) 退火形成的复合物能特异性识别与其互补的 基因组 序列，引导 Cas9 核酸内切酶在目的片段生成 DNA 双链断裂，如下图所示。 通过基因工程手段对 crRNA 和 tracrRNA 进行改造，将其连接在一起得到 sgRNA (single guide RNA)。 通过将表达 sgRNA 的原件与表达 Cas9 的原件相连接，得到可以同时表达两者的质 …

CRISPR-Cas9 是一种细菌获得性免疫，用于降解入侵的外源 DNA。 CRISPR RNA (crRNA) 与转录激活 crRNA (Trans-activating crRNA， tracrRNA)退火形成的复合物能特异性识别与其互补的基因组序列，引导 Cas9 核酸内切酶 在目的片段生成 DNA 双链断裂。 当DNA形成双链断裂切口后，即可触发体内细胞主要的双链DNA断裂修复机制， 主要是非同源重组末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HR）两条途径。 2.gRNA设计. gRNA 负责引导Cas9蛋白到靶基因编辑点，进行互 …

2018年2月16日 · CRISPR Cas9系统只需设计一个包含20个碱基对的RNA寡核苷酸，即可靶向任何基因组位点。 gRNA是CRISPR Cas9系统的重要组成部分，在设计gRNA序列时需要考虑诸多因素。 在细菌和古细菌中，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）形成一个复合体，作为引导Cas9核酸酶降解外来遗传物质的引导装置。 我们将tracrRNA和crRNA结合成一个单一的合成的gRNA，这个单组分系统不仅简化了实验设计，而且还产生了相同或更高的导 …

天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成： SpCas9 (以下简称Cas9)、 crRNA 、 tracrRNA。 其中，crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA (guide RNA)，gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列 (图1)。 为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA [1]，并把其称为sgRNA (single-guide RNA) (图2)。 改造后的CRISPR/Cas9系统成为研究者做基因编辑的首选工具。

2024年8月13日 · 当dCas9连上转录激活子（如VP64、p65和HSF1），通过gRNA引导dCas9到目标基因的启动子或增强子区域，来激活基因的转录。 这些激活因子通过吸引转录机器（如RNA聚合酶和其他转录因子）增加目标基因的转录水平。

2022年2月9日 · 细菌中，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于 PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。 有两种修复切口的方法： 提供一个外源 template DNA序列，两端和切口配对，中间靠DNA修复机制。 主要有2个使用方法： GFP来定位基因组三维结构。 2. 一个植物敲除的例子. 一个载体上2个gRNA的例子。 3. 更多研究. 几乎每种微生物都有自己的Cas9版本，大小和序列都不一样。 切割效率也不一样。 体内测试切割效率。 (3) 如果编辑RNA呢？ RedStones 英语读报， …

2020年5月29日 · CRISPR-Cas9系统是目前最流行的基因组编辑技术，可以实现目的基因的敲除、插入和突变，该技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶基因定性修饰技术。 科学家为了让Cas蛋白定向剪切DNA序列，在CRISPR工作机理的基础上，人为重组了一段目的基因的sgRNA（small-guide RNA），在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以实现对目的基因的定向切割。 本文主要介绍，目的基因sgRNA设计和如何将sgRNA构建到CRISPR-Cas相关载体。 1. 目的基因sgRNA设计.

The gRNA is a short synthetic RNA composed of a scaffold sequence necessary for Cas-binding and a user-defined ∼20-nucleotide spacer that defines the genomic target to be modified. You can therefore change the genomic target of the Cas enzyme by simply changing the target sequence present in the gRNA.

2020年2月29日 · 前文我们提到根据sgRNA、Cas9的产生和投递方式的不同，实验方案也不尽相同。 目前我所了解的有以下几种， 欢迎大家补充： 将具有活性的Cas9和sgRNA直接转入细胞中，适合转染难度大的细胞，但是后续的筛选需要另外设计。 注意：插入不代表一定是过表达，插入破坏启动子可造成敲低或者敲减，因此有一个专业名词为indel (insertion/deletion) 在这里我直接选择将sgRNA整合到pSpCas9质粒中，只转染一个质粒的方法，同时该质粒带有EGFP标记，可用于 …

Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。 在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。 为了方便使用，我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引导RNA（gRNA）。 我们的CRISPR/Cas9 …